Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu podczas pracy, główne wymagania dotyczące jego projektowania, budowy i zarządzania eksploatacją są następujące:
1. Projekt i konstrukcja laboratorium, system bezpiecznej pracy lub standardowe procedury operacyjne w zakresie bezpieczeństwa powinny spełniać wymagania aktualnego GG: Ogólne wymagania dotyczące bezpieczeństwa biologicznego w laboratoriach; GB19489.
2. PCR podzielono na cztery obszary funkcjonalne zgodnie z etapami pracy, a mianowicie obszar przechowywania i przygotowania odczynników, obszar przygotowania próbki, obszar amplifikacji i obszar analizy produktu amplifikacji. Jeśli wyposażony jest w instrument do fluorescencyjnej reakcji PCR w czasie rzeczywistym, można połączyć obszary amplifikacji i analizy produktu. Każdy obszar funkcjonalny musi być wyraźnie oznaczony, a sprzęt i artykuły w różnych obszarach funkcjonalnych nie mogą być mieszane.
Kierunek przepływu powietrza w laboratorium PCR może być dostosowany do obszaru przechowywania i przygotowania odczynników → obszar przygotowania próbki → obszar amplifikacji → obszar analizy produktu amplifikacji, aby zapobiec przedostawaniu się produktów amplifikacji do obszaru wstępnie amplifikowanego wraz z przepływem powietrza. Można to przeprowadzić poprzez obniżenie ciśnienia powietrza z obszaru przechowywania i przygotowania odczynników → obszar preparacji próbki → obszar amplifikacji → obszar analizy produktu amplifikacji. Można to osiągnąć poprzez zainstalowanie wentylatorów wyciągowych, urządzeń wyciągowych podciśnieniowych lub innych wykonalnych metod.
3. Wejście do każdego obszaru roboczego powinno odbywać się ściśle według jednego kierunku, tj. Obszar przechowywania i przygotowania odczynników → obszar przygotowania próbki → obszar amplifikacji → obszar analizy produktu amplifikacji. Należy używać różnych obszarów roboczych (takich jak różne kolory). Pracownicy nie mogą zdejmować odzieży roboczej, gdy opuszczają każdy obszar pracy.
4. Czyszczenie laboratorium należy przeprowadzić w kierunku strefy przechowywania i przygotowania odczynników → strefa przygotowania próbki → strefa amplifikacji → strefa analizy amplifikowanego produktu. Różne obszary doświadczalne powinny mieć własne urządzenia czyszczące, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
5. Po zakończeniu pracy miejsce pracy należy natychmiast wyczyścić. Powierzchnia stołu laboratoryjnego w obszarze roboczym powinna być odporna na dezynfekujące i czyszczące działanie chemikaliów, takich jak podchloryn sodu. Promieniowanie ultrafioletowe na powierzchni stołu laboratoryjnego powinno być wygodne i skuteczne. Ponieważ odległość i energia promieniowania ultrafioletowego są bardzo istotne dla efektu odkażania, można zastosować ruchomą lampę ultrafioletową (długość fali 254nm), a po zakończeniu pracy można ją wyregulować tak, aby napromieniowywać w zakresie 60-90 cm na stole doświadczalnym . Ponieważ amplifikowany produkt ma tylko kilkaset lub kilkadziesiąt par zasad (bp), nie jest wrażliwy na uszkodzenia UV, więc amplifikowany fragment napromieniowany UV musi być naświetlany przez dłuższy czas, najlepiej przez noc.
Funkcje obszaru przechowywania i przygotowania odczynników obejmują: przygotowanie odczynników do przechowywania, dozowanie odczynników i przygotowanie mieszaniny reakcyjnej do amplifikacji, a także przechowywanie i przygotowywanie materiałów eksploatacyjnych, takich jak probówki i końcówki wirówkowe. Materiały takie jak odczynniki do przechowywania i materiały eksploatacyjne używane do przygotowania próbek powinny być bezpośrednio transportowane do obszaru przechowywania i przygotowania odczynników i nie mogą przechodzić przez obszar detekcji amplifikacji. Materiały do kontroli pozytywnej i materiały do kontroli jakości w zestawie nie powinny być przechowywane w tym miejscu, ale powinny być w tym miejscu. Obszar przetwarzania próbek.
Funkcją obszaru przygotowania próbki jest: ekstrakcja kwasu nukleinowego (RNA, DNA), przechowywanie i dodanie do probówki reakcyjnej do amplifikacji. W przypadku operacji obejmujących próbki kliniczne należy spełnić wymagania dotyczące wyposażenia ochronnego, środków ochrony indywidualnej oraz specyfikacje operacyjne dla laboratoriów wtórnych zajmujących się bezpieczeństwem biologicznym. Ponieważ podczas mieszania próbek i oczyszczania kwasu nukleinowego może wystąpić zanieczyszczenie aerozolami, w tym obszarze można ustalić nadciśnienie, aby uniknąć zanieczyszczenia aerozolami z sąsiednich obszarów. Aby uniknąć kontaminacji krzyżowej pomiędzy próbkami, po dodaniu kwasu nukleinowego, który ma być testowany, probówkę reakcyjną zawierającą mieszaninę reakcyjną należy przykryć. W przypadku materiałów potencjalnie zakaźnych pokrywka musi być otwarta w szafie bezpieczeństwa biologicznego i muszą istnieć jasne procedury postępowania z próbkami i ich inaktywacji.
Funkcją strefy amplifikacji jest: synteza DNA, amplifikacja i detekcja DNA. Aby uniknąć zanieczyszczenia powodowanego przez aerozole, należy zminimalizować chodzenie po okolicy. Należy zwrócić uwagę, że w tym obszarze nie wolno otwierać wszystkich testowanych probówek.
Funkcją obszaru analizy amplifikowanego produktu jest: dalsza analiza i oznaczanie amplifikowanych fragmentów, takich jak hybrydyzacja, elektroforeza trawienia enzymów, denaturująca wysokosprawna analiza cieczy, sekwencjonowanie itp. Produkty amplifikacji kwasu nukleinowego mają różne metody analizy, takie jak metody hybrydyzacji sond na błonach lub mikropłytkach lub chipach (znakowanie radionuklidami lub znakowanie nieradioaktywnymi nuklidami), elektroforeza w żelu agarozowym bezpośrednia lub strawiona, elektroforeza w żelu poliakryloamidowym, transfer Southerna, metody sekwencjonowania kwasów nukleinowych, spektrometria mas itp.
Obszar analizy produktu amplifikacji jest głównym źródłem zanieczyszczenia produktu amplifikacji w laboratorium PCR, dlatego należy zachować ostrożność, aby uniknąć przenoszenia produktu amplifikacji przez artykuły i odzież roboczą w tym obszarze. W przypadku stosowania metody PCR-ELISA do wykrywania produktów amplifikacji, do mycia płytek należy użyć myjki do płytek, a zużyty płyn należy zebrać w 1 mol / L HCl i nie można go przelać do laboratorium, ale należy go wyrzucić z laboratorium PCR. Upuszczać. Zużytą końcówkę należy również namoczyć w 1 mol / L HCl, a następnie umieścić w worku na śmieci w celu usunięcia zgodnie z procedurami, takimi jak spalenie. Ponieważ w tym obszarze mogą występować pewne mutacje genetyczne i substancje toksyczne, takie jak bromek etydyny, akrylamid, formaldehyd lub radionuklidy itp., Należy zwrócić uwagę na bezpieczeństwo eksperymentatorów.